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| 影響電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 不同的帶電顆粒在同一電場(chǎng)中亮光黑電泳的速度不同。常用泳動(dòng)度（或遷移率）來表示。泳動(dòng)度是指帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳的速度。 影響亮光黑電泳的主要因素有： 1、首先決定于帶顆粒的性質(zhì)，即顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，大小及形狀。 一般說來，顆粒帶凈電荷多，直徑小而接近于球形，則在電場(chǎng)中亮光黑電泳速度快，反之則慢。泳動(dòng)度還與分子的形狀，介質(zhì)粘度，顆粒所帶電荷有關(guān)，泳動(dòng)度與顆表面電荷成正比，與介質(zhì)粘度及顆粒半徑反比。帶電荷的高分子在電解質(zhì)溶液中把一些帶有相反電荷的離子吸引在其周圍，形成一離子擴(kuò)散層。加以電場(chǎng)時(shí)，顆粒向符號(hào)相反的電極移動(dòng)即帶陽電荷顆粒移向負(fù)極，帶陰電荷顆粒移向正移；離子擴(kuò)散層由于帶有過剩的與顆粒符號(hào)相反的電荷，可以向相反方向移動(dòng)。結(jié)果顆粒與離子擴(kuò)散之間的靜電引力使顆粒的泳動(dòng)度減慢，另外，高分了顆粒表面有一層水，在電場(chǎng)影響下，它與顆粒一起移動(dòng)，可以認(rèn)為是顆粒的一部分。 2、電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)度起著十分重要的作用。例如紙電泳。測(cè)量25厘米長紙條兩端電壓為250伏特，則電場(chǎng)強(qiáng)度為250伏特/25厘米=10伏特/厘米。 一般，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒移動(dòng)速度越快。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度大小，可將電泳分為常壓電泳和高壓電泳，前者的電壓在100-500伏特，電場(chǎng)強(qiáng)度一般是2-10伏特/厘米；后者電壓可高達(dá)500-1000伏特，電場(chǎng)強(qiáng)度在200-2000伏特/厘米。常壓電泳分離時(shí)間需數(shù)小時(shí)至數(shù)天，高壓電泳時(shí)間短，有時(shí)僅幾分鐘即可，高壓電泳主要用于分離氨基酸，肽，核苷酸，由于電壓升高，電壓也隨之增大，故需冷卻裝置。 3、電滲作用 在支持物的電泳中，影響電泳的另一個(gè)重要因素是電滲作用。所謂電滲就是指在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，例如在pH8.6時(shí)，血清蛋白質(zhì)進(jìn)行紙電泳時(shí)，γ球蛋白與其他蛋白質(zhì)一樣帶負(fù)電荷，應(yīng)該向正極移動(dòng)，然而它卻向負(fù)極方向移動(dòng)，這就是電滲作用的結(jié)果。濾紙的纖維間具有大量孔隙帶有負(fù)電荷，如一束毛細(xì)管，進(jìn)行電泳時(shí)蛋白質(zhì)通過這些孔隙向前移動(dòng)。紙的孔隙帶有負(fù)電荷，與帶電顆粒一樣可以吸引正離子，因此介質(zhì)沿管壁相對(duì)地帶的較多的正電荷。在電場(chǎng)中，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)，而介質(zhì)卻向反向陰極移動(dòng)，從而對(duì)蛋白質(zhì)顆粒的泳動(dòng)起阻礙作用。由于γ球蛋白分子顆粒大，凈電荷較少，移動(dòng)速度慢，電滲作用大于顆粒向前泳動(dòng)的力，結(jié)果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白質(zhì)，因分子較小，凈電荷較多，電滲作用小于分子向前移動(dòng)的力，因此分子向前移。所以，血清蛋白質(zhì)電泳后球蛋白反而在點(diǎn)樣位置之后。 4、溶液的pH值 溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質(zhì)所帶凈電荷的多少，對(duì)于蛋白質(zhì)，氨基酸等兩性電解質(zhì)而言，溶液pH值離電點(diǎn)越遠(yuǎn)，顆粒所帶凈電荷越多；電泳速度越快；反之則越慢。例如血清中幾種主要蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)各不相同，白蛋白等電點(diǎn)是4.0。α2球蛋白等電點(diǎn)是5.06，β球蛋白等電點(diǎn)是5.1，γ球蛋白等電點(diǎn)是7.1。當(dāng)在pH8.6的電泳緩沖液中電泳時(shí)，這些蛋白質(zhì)都帶負(fù)電荷，它們的泳動(dòng)速度是白蛋白 <α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此，當(dāng)要分離一種蛋白質(zhì)混合物時(shí)，應(yīng)選擇一種能擴(kuò)大各種蛋白質(zhì)所帶電荷量差異的pH值，以利于各種蛋白質(zhì)分子的解離。同時(shí)，為保持電泳過程中溶液pH恒定也須使用緩沖液。 5、溶液的離子強(qiáng)度 溶液的離子強(qiáng)度是另一個(gè)重要選擇的條件，在保持足夠緩沖能力前提下，離子強(qiáng)度要最小。溶液的離子強(qiáng)度越高，帶電顆粒泳動(dòng)速度越慢，反之越快。濃度大的緩沖液在合適電壓下，有較低的電阻和較大的電流，產(chǎn)熱較高。如果這種額外的熱可以驅(qū)散，高濃度的緩沖液擴(kuò)散常數(shù)較低，可以產(chǎn)生較窄細(xì)的電泳區(qū)帶。離子強(qiáng)度很高時(shí)要用低電壓，避免過多產(chǎn)熱，這樣又導(dǎo)致長的電泳時(shí)間，以致增加變性和區(qū)帶分離困難。 |
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